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    組織培養污染產生的原因及防治措施(黃化&褐化)

    文章作者:zhuobo 發布時間:2021-03-02 17:54:18 瀏覽次數:0

      隨著生物技術的發展,組培生產技術在我國農業生產中應用速度很快,我國組培工業化生產始于20世紀70年代,近年來這項技術的應用范圍十分廣泛,尤其在作物育種、苗木及花卉的脫毒和快繁等方面更具其他技術手段所無法比擬的優勢。雖然組織培養技術操作并不難,但對一些技術環節的要求卻十分嚴格,稍有疏忽便會延誤實驗進程,甚至導致整個試驗失敗,為此我們必須重視在組織培養生產過程中污染帶來的危害。

    組織培養

      組織培養過程中污染的來源

      外植體自身帶菌

      許多植物都是栽培在室外,而空氣環境中有大量微生物存在,這些微生物可通過植物自然的孔口或傷口進入植物內部,也有一些兼性腐生菌,可由外植體或通過相應的侵入機制侵入植株內部,如果在接種操作前對這些認識不足,對外植體消毒不嚴,就很容易發生污染現象。

      培養基或接種工具滅菌不徹底

      在對培養基滅菌過程中,如果滅菌時間過短、滅菌時溫度達不到要求、滅菌鍋壓力記數不準等因素都有可能導致培養基滅菌不徹底,使一些病原微生物殘留在培養基中,一旦接種后就會造成污染。使用滅菌不徹底的接種工具,滅過菌的接種工具存放時間過長,都會導致在生產中造成污染,所以生產中要做好培養基和接種工具的滅菌和消毒工作。

      接種室消毒不嚴

      在組培生產過程中,除了植物本身外,大部分污染來源便是來自接種操作室。因為在接種操作室中,未過濾的空氣中含有大量的微生物,這些微生物可隨著操作人員或植株接觸時而發生污染,所以接種室消毒不嚴,也易引發污染發生。

      人員因素

      在整個操作室內,人員是最大的帶菌者,其不管在毛發或是衣服等,都隱藏著數不清的微生物。這些微生物的存在都可能造成一定的危害。為此在進入操作室前,接種人員的工作服、鞋帽都必須進行消毒處理,進入接種室必須換上消毒過的鞋帽;接種前,接種人員必須認真洗手,還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手,這樣在一定程度上可減輕污染的危害。

      超凈工作臺上的濾網過濾不徹底

      超凈工作臺使用過久,或保養不當,而造成濾網壞掉或灰塵過多,導致在接種操作時對空氣過濾不徹底,也易產生污染。

      栽培過程污染

      在栽培室,組培瓶外和外界氣體交換時,亦會有一些微生物進入。污染幾率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

      防止污染的方法

      認真做好外植體的選擇和消毒工作,防止外植體帶菌

      對外植體的選擇要考慮選擇的時間和部位,盡量選取帶菌少的材料,在時間上一般在植株的生長旺盛季節,如春季和秋季病原微生物數量相對要少些,對于外植體的部位一般以幼嫩的部位較好。

      另外要做好外植體的消毒工作,目前外植體消毒常用藥劑有:70%~75%的乙醇溶液,0.3%~0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升gong溶液。選用何種消毒劑和消毒時間要根據外植體的幼嫩程度和部位確定,一般要求既將外植體表面的微生物殺死,又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。在生產實踐中防止外植體污染,也可實行多次滅菌和交替滅菌相結合的辦法,最終達到消滅雜菌的目的。

      改善接種室和培養室的環境條件,保證接種與培養環境清潔無菌

      與外植體自身帶菌所產生的污染相比,操作污染和環境污染是可以克服的。在組培生產中,真菌的污染一般與環境有關,細菌污染與接種材料及工具有關。生產中要通過定期做好對接種室與培養室消毒工作,減少環境中的微生物數量,減輕對污染的危害。為此,在接種前接種室要認真做好消毒工作,且超凈工作臺在接種前,認真擦洗,紫外燈要開20~30min左右。培養室的相對濕度應控制在70%左右,對每件物品放到超凈工作臺上,都要用75%酒精認真擦洗一遍,方可放到臺面上,只有這樣在一定程度上可控制污染程度。

      操作人員嚴格遵守無菌操作規程

      接種人員在接種操作中,應嚴格遵守無菌操作規范要求。接種人員的工作服、口罩、帽子等布質品要定期進行濕熱滅菌,在超凈工作臺的操作區內,不要放入過多的待用物品,避免氣流被擋住產生污染。定期清洗或更換超凈工作臺過濾器,接種前15~20min打開風機,風速調整到20~30m/min,并對臺面用75%酒精噴霧消毒,工作人員進入操作室前必須對工作服、鞋帽進行消毒處理,進入接種室必須換上消毒過的鞋帽,接種前,接種人員必須認真洗手,還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手,只有接種過程中嚴格遵守操作要規范,才可避免因人為因素造成污染。

      培養基及接種工器具要嚴格滅菌,確保滅菌質量

      在對培養基和接種工具滅菌時,要先檢查滅菌鍋的使用情況,發現問題要立即檢修。在滅菌過程中要絕對保證滅菌應達到的壓力、時間,確保滅菌質量。一般要求壓力應達到0.1個大氣壓,時間維持在15~20分鐘,并且壓力表降到零后不能馬上出鍋,防止外界環境的冷空氣倒吸入已滅菌的培養瓶內引起真菌污染,應待鍋內稍冷卻后再出鍋。對組培生產過程中培養容器封口采用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等材料,在使用前要認真做好清冼和消毒工作,不符合要求堅決不用。在分裝培養基時,勿觸瓶口,防止培養基粘在瓶口上,引起污染,瓶口封好后要檢查封口是否破損,扎瓶口位置適當,松緊適宜。對已污染組培瓶要經高壓滅菌后再清洗。

      在培養基中加入適量的抗生素

      這是目前較常用的方法,抗生素可以直接加入到培養基中,也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。但植物種類不同,所用抗生素的種類、濃度和處理時間也不同,因此必須對不同植物采用不同的抗生素的種類、濃度和處理時間進行實驗探討。

      一般情況下,為消除革藍氏陽性菌對有些木本植物污染莖段組培苗,可在培養基中加入四環素、頭孢等混合物,可使細菌完全被消除。另外用頭孢菌素Ⅱ消除某些觀賞植物外植體中的內生菌也有非常明顯的效果。

      利用病毒在植株體內分布不均勻的原理,生產脫毒苗

      因為病毒在生長點區域幾乎不存在,且病毒也難以長到頂芽的分生組織,所以切取頂芽的分生組織進行組織培養,通過組織培養技術就可培養成無病毒植株,而且脫毒效果好,后代遺傳性穩定,所以是目前生產無病毒苗最安全、最重要的一條途徑。

      利用培養基中高鹽或高糖的濃度,抑制微生物的生長

      在培養基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物生長,或單寧酸存在時也可以達到抑制微生物生長的效果。

      減少培養基中的某些有機成分,可抑制微生物的生長繁殖

      培養基中有機物如VB1、VB6、煙酸等有機成分,是某些細菌生長的必需物質,除去這些有機物后,細菌無法生長發育,逐漸死亡減少。這樣也可在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

      組培生產中污染的發生是不可忽視的環節,在生產過程中思想上要高度重視,行動上要有嚴格遵守操作規范,才能在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

    組織培養

      組培苗的黃化及防治

      組培苗的黃化

      黃化是指在組培過程中由于培養基成分、環境、激素、碳水化合物等各種因素引起的幼苗整株失綠,全部或部分葉片黃化、斑駁。這一現象在植物組織培養中比較常見,特別在部分木本植物、花卉中較為常見。

      影響組培苗黃化的因素

      1、培養基中Fe的含量不足, 各礦質營養不均衡;

      2、培養環境通氣不良,瓶內乙烯含量升高;

      3、激素配比不當;

      4、PH值變化過大;

      5、糖用量不足或長時間不轉移糖已耗盡;

      6、培養溫度不適;光照不足等。

      防治組培苗黃化的方法

      1、首先在配制母液和培養基的制作過程中,要檢查儀器設備是否準確,還要認真細致地核對每項稱量的每一個環節;

      2、使用透氣的封口膜以改善瓶內通氣狀況;

      3、適當調節pH值、激素配比和無機鹽濃度;

      4、配制培養基時切記不要忘記加糖,及時轉接培養物;

      5、控制培養室內的溫度,適當增加光照;

      6、在培養基中添加抗生素類物質如青霉素、鏈霉素、頭孢霉素等,有時也會出現幼苗黃化現象,應適當減少用量或停止使用。

    組織培養

      組培苗的褐變及防治

      組培苗的褐變

      很多種類的植物體中含有大量多酚類化合物,切取芽時的創傷會激活組織中的多酚氧化酶,將多酚類物質氧化為棕褐色的醌類物質,使外植體的切口處發生褐變,產生可見的茶色、褐色或黑色,此即謂“酚污染”。醌類物質會滲透到培養基中,使培養基褐化,其結果是嚴重影響培養物的生長和分化,甚至造成培養物死亡。在木本植物,尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中,此現象較為嚴重。

      影響褐變的因素

      植物的種類褐基因型、外植體的來源和生理狀況以及培養基的成分都會不同程度的影響褐變的程度。一般木本植物的外植體比較容易產生褐變現象,在成年樹尤其嚴重。培養基中含酚過高會導致褐變,含過高濃度的無機鹽和肌醇也會加劇外植體的褐變。6-芐氨基嘌呤(6-BA)和激動素(KT)也有誘導褐變的作用。強光和高溫同樣會促進褐變現象。

      防治褐變的方法

      1、在培養基中加入抗氧化劑是防止褐變的有效措施。

      常用的抗氧化劑有抗壞血酸(VC)、檸檬酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。

      具體方法如下:

      (1)用經過濾滅菌的抗氧化劑溶液洗滌剛切割的外植體傷口表面;

      (2)將抗氧化劑加入固體培養基的表層;

      (3)將剛切割的外植體浸入其中一定時間,

      (4)或者在抗氧化劑溶液中切割和剝離外植體。

      (5)必要時還可以將幾種抗氧化劑結合使用。

      2、在培養基中加入活性炭,吸附對生長有抑制作用的褐色醌類物質。

      一般認為,活性碳主要吸附非極性物質及色素大分子,可以減少一些有害物質的影響,但是具體吸附的選擇性很差,溫度低時吸附力增強,溫度高時吸附力減弱,甚至會解吸附。通?;钚蕴康氖褂脻舛葹?.5-10g/L。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力,因此要多加些瓊脂;很細的活性炭容易沉淀,因此通常在瓊脂將要凝固時,需輕輕搖動培養瓶;應當注意的是:活性炭也能吸附培養基中的激素類物質,影響莖尖的分化和生長,因此在使用活性炭的場合,需要適當提高培養基中激素的濃度。

      3、不斷地(每隔1~2d)將培養物轉移到新鮮的培養基上,以擺脫老培養基中褐色物質的不利影響。在使用液體培養基的情況下,這種方法相當有效。

      4、為了防止外植體的褐變,需要選取酚類化合物含量較低的實驗材料,選擇無機鹽含量較低,不加肌醇的培養基,并在較弱的光線或黑暗的條件中進行培養。

      5、易發生褐變的植物在進行組織培養時,先進行預培養(即培養在基礎培養基中)2-3天(如果分泌物多,如利用花魔芋的球莖進行組織培養時,適當延長預培養時間并多次更換培養基),再培養到添加了激素的培養基上。

    組織培養

      組織培養的條件和培養基制備注意事項

      1、植物組織培養的整個操作和培養過程都要求在嚴格無菌條件下進行,無菌是組織培養成功的首要條件。操作過程在接種室內超凈工作臺上進行;外植體材料要進行表面消毒;配制的培養基要進行高壓滅菌消毒。

      2、溫度處理操作和培養過程都是在恒溫條件下進行,一般在23—27℃之間,熱帶植物可偏高些,脫毒植物需要高溫處理。

      3、光照處理植物的器官必須有光,某些植物器官的生成是在無光條件下,但它的生長和發育必須有光。莖尖的生長及試管苗的繼代增殖以3000-5000lux光照強度適宜;生根試管苗以3000lux適宜。光質對愈傷組織誘導、增殖、器官的分化有不同的影響。光周期誘導一般是16h,黑暗是12h,對光周期敏感植物要掌握光照時間,否則影響植物的分化。

      4、培養基的酸堿度因植物的種類不同而有區別,大多數植物要求在5.8之間,喜酸性培養的植物要求的酸堿度較嚴格。

      培養基的成分

      1、用于植物組織培養的培養基迄今不下幾十種。歸納起來任何一種培養基均有以下幾部分組成:無機鹽(大量元素、微量元素),有機化合物(蔗糖、維生素類、氨基酸、核酸及其他水解化合物),鐵鹽螯合劑,植物激素。

      植物激素的純度對于組織培養的成功至關重要。接種的外植體,其分化速度(長芽)和分化方向(長根),均取決于所加激素的種類、數量及比例。簡言之,主要是生長素和細胞分裂素的加入量以及兩者的比例。一般生長素類包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸;細胞分裂素類包括激動素、芐基氨基嘌呤、二甲基丙烯氨基嘌呤。

      培養基中的糖類主要是蔗糖,少數情況下使用葡萄糖。大量生產可使用蔗糖。糖在培養基中的作用是提供碳源,同時用于維持滲透平衡,瓊脂是固體培養基中的成分,作為固化劑支持。培養物在培養基的成本消耗中,瓊脂占有相當大的比例,培養基中瓊脂的加入量一般為4-7g。

      2、在組織培養生產中,培養基的制備對母液的需求量相當大,需一批一批地連續配制。為簡化配制過程,提高工作效率,一般將各種所需藥品先配制成高濃度溶液,貯備起來。到配制培養基時,按要求的濃度取一定量稀釋即可;我們稱這些高濃度的溶液為貯備液,習慣上稱母液。

      制備母液時,先將所有藥品分成幾組,每組藥品制成一種母液。分組的原則是同組藥品混合溶解時不會發生質的變化,也不產生沉淀。一般將藥品分成5組:大量元素、微量元素、鐵鹽、有機化合物類和植物激素。其中植物激素母液有若干種,每種激素都先制成1mg/ml的溶液。

      母液制備注意事項

      1、藥品稱量要盡可能準確。大量元素用百分之一天平稱取,而微量元素、有機物類、植物激素等,則必須使用萬分之一的天平。

      2、母液配制完畢注入試劑瓶后,一定要標明母液的名稱、序號、濃度和配制日期等。

      3、配制好的母液應放置在冷藏箱內保存,尤其是有機物和激素類。

    組織培養

      培養基的配制

      1、將用于配制培養基的容器洗凈,加入培養基總量四分之三的蒸餾水,放入所需的瓊脂和糖,然后加熱溶解。在加熱過程中應不斷地攪拌,以避免瓊脂粘鍋或溢出。

      2、待瓊脂和糖完全溶解后,按順序加入各貯備液以及所需的植物激素。

      3、用蒸餾水定容補充由于加熱蒸發所損失的體積。

      4、用蒸餾水調整pH。

      5、通過漏斗或下口杯將培養基注入組組織培養容器內,注入量為瓶容積的十分之一左右。灌裝要迅速,盡可能避免培養基粘在瓶壁上,且應在培養基未冷卻之前灌裝完畢。

      6、用封口膜或含透氣膜的塑料蓋將瓶口或試管口封嚴。

      7、將封裝好的組織培養容器碼放在高壓滅菌鍋內。于105Pa壓力、121℃下滅菌20分鐘。如使用小型手提式滅菌鍋時,一定要注意,當鍋內壓力上升時,先反復放氣數次,將鍋內空氣排盡以后,再計算時間,否則達不到高壓滅菌的效果。

      8、對于一些受熱易于分解的物質,如維生素類,可采取先過濾滅菌的方法。待培養基滅菌后,尚未冷卻之前(40℃左右)加入并搖勻。經過高壓滅菌的培養基可在室溫下存放3-5天,或在冷藏箱內存放10天左右,最好在短時間內用完。


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